Инструменты и Методы анализа

Оборудование | Методы и протоколы | Программы | Реактивы и материалы | Стоимость анализа

.......................................................................................................................................................................................

Электронная микроскопия ⇒ Тетрооксид осмия (OsO₄) или оксид осмия VIII

Меры предосторожности при обращении с тетрооксидом осмия

С тетрооксидом осмия (OsO₄) необходимо обращаться очень осторожно вследствие его высокой токсичности и его паров. Кристаллический осмий быстро испаряется, именно поэтому он хранится и поставляется в запаянных стеклянных ампулах при особых требованиях к безопастности при транспортировке. Давление насыщенного пара твердого, кристаллического OsO₄, составляет 11 мм ртутного столба при 25°C (у воды – 17, у ртути – 0,0013). OsO₄ - очень сильный окислитель. При несоблюдении правил обращения с ним его пары поражают в первую очередь глаза, гортань и верхние воздухоносные пути. В частности, вдыхание паров OsO₄ в тех концентрациях, которые даже ниже нашего порога восприятия его запаха могут приводить к отеку легких и последующей смерти. При этом симптомы могут проявиться лишь спустя несколько часов. Необходимо также избегать контакта рук и других частей тела с кристаллами или раствором OsO4. С тетрооксидом осмия можно работать только в вытяжном шкафу (с включенной вентиляцией). Поскольку OsO₄ довольно дорогой по стоимости реактив, нестабильный, летучий, то готовить его необходимо очень аккуратно, с максимальной осторожностью.

Обычно используют OsO₄ в виде 1%-2% растворов в воде или буфере, и реже в органических растворителях, например ацетоне, тетрахлорметане, гидрохлориде аммония и др., с которыми OsO₄ образует комплексные соединения. OsO₄ – очень сильный окислитель, он быстро восстанавливается (чернеет) до OsO₂ в присутствии органических молекул (гл.обр. с ненасыщенными связями) и под воздействием света. Присутствие даже незначительного количества органических примесей приводит к восстановлению OsO₄ до гидратированного диоксида, что делает его непригодным для фиксации биологической ткани. Если раствор OsO₄ приготовлен довольно давно, но все же не потемнел, а при погружении в него биологической ткани она также не чернеет, вероятнее всего основная часть OsO₄ улетучилась; такой реактив работать не будет.

Предотвратить восстановление OsO₄ до OsO₂ можно, если полностью исключить попадание в раствор пыли и органических примесей, и хранить раствор в емкости из коричневого стекла. Следует быть очень аккуратным и внимательным, дабы исключить попадание в раствор пыли и уберечь раствор от лишнего воздействия света.

При хранении раствора OsO₄ в холодильнике пластиковые стенки постепенно чернеют за счет испарений OsO₄, это же будет происходить и с остальным содержимым холодильника, включая другие реактивы. Пары OsO₄ проникают через пластик. Растворы с этим тяжелым металлом не следует сливать в общую канализацию.

Для нейтрализации OsO₄ следует выливать в емкость стоящую под вытяжкой и содержащую растительное масло. Для нейтрализации раствора OsO₄ необходимо использовать растительное масло, содержащее много ненасыщенных связей, при этом количество масла должно быть приблизительно в 3 раза больше раствора металла для полной его нейтрализации. Случайный разлив раствора OsO₄ можно нейтрализовать пропитанным маслом бумажным полотенцем.

Приготовление раствора тетрооксида осмия (оксид осмия VIII)

Для приготовления понадобится посуда:
- емкость для разведения/хранения раствора OsO₄,
- две стеклянных воронки,
- стеклянная палочка диаметром меньше горлышка воронок,
- стеклянный стаканчик.

Также необходимы:
- тонкие лабораторные перчатки
- кусок бумажного полотенца,
- бумажные салфетки или приспособление для разлома стеклянных ампул,
- растительное масло,
- алюминиевая фольга.

На первом этапе приготовления водного раствора тетрооксида осмия следует удалить этикетку/наклейку со стеклянной ампулы с кристаллами OsO₄, НО! делать это стоит только после того как вы ее прочитали. (Тетрооксид осмия продается также в стеклянных ампулах в виде водного раствора.) Итак, после того как этикетка удалена, хорошо промываем ампулу, емкость в которой будет храниться раствор, стеклянную воронку, и стеклянную палочку в концентрированной азотной кислоте (для удаления органических примесей) и затем хорошенько промываем в дистиллированной воде для удаления остатков кислоты.

Емкость, две воронки, стеклянную палочку и стеклянный стаканчик следует высушить в сушильном шкафу; ни в коем случае не вытирать полотенцем и насколько возможно исключить их контакт с комнатной пылью, т.к. в обоих случаях неизбежно попадание в раствор тетрооксида осмия волосков/пылинок, что, в конечном счете, приведет к его восстановлению до OsO₂.

Отмеряем необходимое количество воды, буфера или другого растворителя для приготовления раствора требуемой концентрации раствора OsO₄. В емкость для раствора OsO₄ вставляем стеклянную воронку, наливаем половину отмеренного растворителя, меняем воронку на сухую.

Стеклянную ампулу замораживаем в морозилке холодильника в течение нескольких часов или в течение 10-30 сек в жидком азоте. Замораживание нужно для кристаллизации парообразного OsO₄ и для того чтобы кристаллы хорошо ссыпались с внутренних стенок ампулы, заодно это уменьшает испарение тетрооксида при приготовлении раствора. Из жидкого азота достаем ампулу металлическим пинцетом, стряхиваем кристаллы на дно ампулы, разламываем ампулу в области шейки, или по предварительно нанесенной абразивом насечке (ампулы могут уже иметь насечку сделанную производителем). Во избежание ранения осколками стекла в области разлома можно было бы обернуть ампулу несколькими слоями салфеток, но это чревато попаданием ворсинок в конечный раствор OsO₄, поэтому рекомендуется использовать специальное приспособление для разлома стеклянных ампул (можно найти у компаний производителей материалов для электронной микроскопии именуемые как Ampoule Neck Breaker). При отсутствии такого приспособления, можно заранее подобрать подходящий по диаметру головки ампулы чистый высушенный Эппендорф. Одеваем его на головку ампулы, отламываем головку и высыпаем кристаллы в воронку в емкость для раствора OsO₄, палочкой можно постучать по стенкам ампулы, чтобы стряхнуть оставшиеся кристаллы или протолкнуть застрявшие в горлышке воронки, стенки воронки обмываем оставшимся объемом растворителя. Емкость быстро закрываем пробкой и энергично перемешиваем.

Ампулу можно не замораживать, в таком случае после разлома ее осторожно опускают в емкость с растворителем, или разбивают не разломанную ампулу толстой стеклянной палочкой уже в самой емкости для раствора. Емкость быстро закрываем пробкой и энергично перемешиваем.

Растворение кристаллов тетрооксида осмия

Для полного растворения кристаллов OsO₄ в воде или буффере требуется несколько часов (процесс можно ускорить ультразвуковым излучением, НО! всегда остается ОПАСНОСТЬ разрушения стекла при ультразвуковом воздействии). Можно просто поставить емкость с водным раствором OsO₄ в термостат на +60°C, на следующий день раствор будет готов к использованию.

OsO₄ гораздо легче растворяется в органических растворителях, например, в ацетоне, даже при комнатной температуре (нагрев ацетона не требуется). Внимание! Ни в коем случае не ставим емкость с раствором OsO₄ в ацетоне в термостат на +60°C. Температура кипения ацетона = +56.1°C. Но если Вы это сделали, то через некоторое время результатом будет взрыв грязной бомбы в вашей лаборатории. Даже если это произойдет в отсутствие персонала, и никто при этом не пострадает от паров еще не восстановленного OsO₄, вы как минимум потеряете дорогой реактив, испортите лабораторное оборудование, и насытите лабораторную среду пылью оксида тяжелого металла, который будет в дальнейшем отфильтровываться вашими же легкими. Как вам такая перспектива?

Хранение растворов тетрооксида осмия

После того как кристаллы полностью растворились емкость хранят в холодильнике. Водные растворы можно хранить или при комнатной температуре в вытяжном шкафу, или при +4°C. Растворы в более летучих растворителях следует хранить в морозльной камере при сильно отрицательных температурах. Раствор должен быть защищен от света и загрязнения органическими веществами и лабораторной пылью.

Поскольку OsO₄ очень летуч и его растворы быстро теряют исходную концентрацию, растворы OsO₄ следует готовить маленькими порциями (например, по 50 мл) и хранить в конических колбах под стеклянной пробкой с тефлоновым уплотнителем.

Использование просто притертых пробок категорически не рекомендуется, поскольку они не обеспечивают герметичности и сохранения исходной концентрации OsO₄ в растворе, даже если он хранится при +4°C. Разумеется, можно хранить и под притертыми крышками (например, в маленьких кислотницах), но при таких условиях он менее стабилен. Измерения летучести готового раствора OsO₄ показывают, что в течение 24 часов 2.22% водный раствор OsO₄ теряет 3% своей исходной концентрации (остается 2,15% OsO₄ в растворе), когда хранится под обычной притертой крышкой даже при 0°C; при этом из растворов меньшей концентрации OsO₄ имеет тенденцию улетучиваться гораздо быстрее.

Различия в концентрациях OsO₄ в растворе ведут к ошибочной интерпретации электронно-микроскопических изображений, особенно в количественной электронной микроскопии. Разумеется, для того чтобы знать концентрацию of OsO₄ в образце ткани, необходимо знать его концентрацию в исходном растворе фиксатора.

Единственный эффективный способ сохранения водного раствора OsO₄, это обязательное использование тефлоновых прокладок между емкостью и стеклянной пробкой. Емкость следует плотно закупорить, обернуть в 2 слоя алюминиевой фольги и/или поместить в светонепроницаемую коробку и хранить в холодильнике при +4°C. При соблюдении вышеуказанных условий, в холодильнике, раствор стабильно сохраняет свои свойства в течение нескольких месяцев.