Инструменты и Методы анализа

Оборудование  |  Методы и протоколы  |  Программы  |  Реактивы и материалы  |  Стоимость анализа

.......................................................................................................................................................................................

   Фото - обработка фотопленок и негативов                                                                                                                                                      

  Пленки
  Нарезка пленки
  Проявитель
  Время проявки
  Фиксаж
  Промывка
  Вуаль
  Осветление

.......................................................................................................................................................................................

   Пленки

Несмотря на то, что современные электронные микроскопы оборудованы цифровыми камерами для захвата изображения, далеко не во всех случаях цифровые камеры могут вытеснить фотопленки из электронно-микроскопических исследований. Анализ литературы и собственный опыт говорят о том, что цифровой захват не всегда отличается качеством изображения, и подчас не экономит времени идущего на обработку фотоматериалов и сканирование негативов.

KODAK® Electron Microscope Film 4489™

Фотоматериалы для электронной микроскопии производимые компанией KODAK® несомненно остаются лидерами по качеству получаемого изображения. Пленка KODAK® EM Film 4489™ (SPI, CM, EMS, EMS, TP) наиболее широко используется в мире для электронной микроскопии, и это не случайно. Превосходное качество получаемого изображения, проработка деталей, удобство при работе с этой пленкой делают ее уникальной в своем роде. Предпринималось немало попыток повторить результаты получаемые на этой пленке, но большинство микроскопистов, кто работал с ней, согласится, что по своим свойствам этому продукту нет равных.

Единственный минус - цена этого бренда. Она слишком высока. Например, Polyscience Inc. в 2010 г. упаковку из 100 листов 6.5×9 см продавала в Европе за 280€ (около 11000 руб.). С учетом доставки и услуг перекупщиков, она будет стоить в России около 22000 рублей !!!
Разумеется, никакого гранта РФФИ при таких ценах на нормальную работу не хватит.

И неудивительно, что стоимость одного негатива в электронномикроскопических исследованиях столь высока.

MACO™ Electron Microscope Films (Германия)

В качестве альтернативы, компания SPI предлагает пленку MACO™ EM.

В характеристиках указано, что пленка оптимизирована для использования в электронно-микроскопических исследованиях. В качестве особых преимуществ отмечены:
- высокая упругость основы;
- высокая чувствительность;
- высокое разделение тонов;
- оптимальная разрешение деталей.

Однако и эта цена велика.
SPI предлагает 100 листов 6.5×9 см за 125$.
С учетом доставки в Россию - более 250$. Т.е. около 7500 руб за пачку.

Фототехническая пленка ФТ-41МД (ФоМос)

В 2010 г. эту пленку можно было приобрести в компании Техастор.

Светочувствительность пленки S_0,85 от партии к партии колеблется от 5,5 до 6,5. В качестве особых отрицательных характеристик по сравнению с вышеуказанной KODAK 4489 отмечу:
- низкую упругость основы ;
- относительно слабую проработку деталей;
- вуаль.

Работать с пленкой тяжело, вследствие низкой упругости основы пленки могут вылетать из кассет фотокамеры и "уплывать" из корзинки при обработке в бачке. Вытянуть необходимого разрешения до уровня KODAK порой не удается даже двукратным увеличением микроскопа. При обработке пленки проявляется вуаль, даже на новоприобретенной у дилеров пленке. По-видимому, есть проблемы с условиями транспортировки и хранения. На форуме микроскопистов г. Черноголовки можно почитать мнения других людей c опытом работы с ФТ-41.

Тем не менее, цена приемлема. Техастор в 2010 г. предлагал 100 листов 30×40 см за 5000 руб, или в около 300 руб за 100 листов 6.5×9 см, что на два порядка дешевле KODAK 4489.

Увы, ФоМос уже не существует (в каталоге Техастор можно видеть ФТ-41П, но реально на 23.05.2011 продаются остатки партии ФТ-4МД производства ФоМос от марта 2010).

Подобную пленку, ФТ-41П, можно приобрести у компании Татарские светочувствительные материалы - "Тасма" по 6622 руб (на 23.05.2011) за 100 листов 30 х 40 см. Технические характеристики ФТ-41П можно найти на сайте производителя. Проявлять пленку рекомендуется в проявителе ФП-2.

.......................................................................................................................................................................................

   Нарезка пленки

Важно !!! Все операции с пленкой следует проводить в темной комнате, при слабом красном свете. Важно, чтобы все плейеры, мобильные телефоны и тому подобные устройства были выключены.

Листы пленки размером 30×40 см можно нарезать представленным на рисунке способом. Изкаждого листа получается 18 кадров размером 6,5×9 см. Формат пластинок Kodak Electron microscope film ESTAR Thick Base 4489 составляет 63×88 mm. В кассетах JEOL они болтаются. Это нежелательно. Хорошо в кассетах сидят пластинки размером 65×90,5 мм. Но поскольку точность резки ручной невелика, то лучше резать не 90,5, а 90 мм, и не 65, а 64,5 мм. На рисунке эти координаты выделены красным цветом. Иначе некоторые пленки могут быть чуть больше и не влезут в кассету.

Для резки пленки более удобно использовать роликовый резак для бумаги нежели сабельный. В настоящее время большой выбор роликовых резаков можно найти в компании rezak.ru. Если позволяет размер резака, то разрезаем лист пленки 30×40 см сначала на длинные полосы, а затем длинные режем на отдельные кадры. Обрезки не выбрасываем - пойдут на тестирование.

.......................................................................................................................................................................................

   Проявитель

Рецептов приготовления проявляющих растворов для черно-белой пленки множество. Их можно найти и в литературе и в интернете, включая сайты производителей. Здесь я привожу тот, что использую для проявки ФТ-41.
(!) Сразу отмечу, что данная пленка и проявитель подобраны для микроскопии клеток и тканей с относительно равномерным распределением плотности структур. Для качественной микроскопии прокариот или молекул в низкой концентрации на подложке могут потребоваться свои особые условия: специально подобранная пленка, экспозиция при съемке, реактивы и т.д.

Объем проявителя	1 литр	2 литра	3 литра
Вода	0,750 л	1,500 л	2,250 л
Метол	2 г	4 г	6 г
Cульфит натрия (натрий сернистокислый) безводный [Na2SO3] или кристаллический [Na2SO3×7H2O]	22,5 г 52 г	45 г 104 г	67,5 г 156 г
Гидрохинон	4 г	8 г	12 г
Натрий углекислый (сода) безводный [Na2CO3] или кристаллический [Na2CO3×10H2O]	20 г 56 г	40 г 112 г	60 г 168 г
Калия бромид	1 г	2 г	3 г
Вода	до 1 л	до 2 л	до 3 л

   Разводим в том порядке, в котором указано в таблице. Воду исходно можно подогреть до 40°C.

.......................................................................................................................................................................................

   Время проявки

Как правило, после работы на микроскопе необходимо проявить несколько корзинок по 25 листов в одном и том же объеме проявителя.

Для проявления одной корзинки с 25 листами пленки ФТ-41MД размером 6,5×9 см в 3-х литрах свежеприготовленно проявителя (рецепт см. выше) при комнатной температуре (16-18°C) требуется 4 минуты. При этом время проявки каждой последующей корзинки в том же проявителе следует увеличить.

На данном рисунке представлена приблизительная зависимость увеличения времени проявки от порядкового номера проявляемой корзинки. Время проявки определено практически, используя ниже указанный Способ 1. График составлен для проявки 13 корзинок по 25 листов пленки ФТ-41MД размером 6,5×9 см, однако проявлять в том же растворе более 8-10 корзинок без добавления в проявитель восстанавливающего раствора нежелательно. С увеличением времени проявки появляется вуаль. Над кривой для каждой корзинки указано время проявки.

Как это часто бывает, количество проявленных пленок/корзинок в дном и том же проявителе пользователями не всегда учитывается. Если время проявки неизвестно, то его можно определить.

Способ 1:

Отрезаем полоску засвеченной пленки и, отсчитывая секунды, на счет ноль погружаем ее на 3-4 см в проявитель, по истечении третьей секунды погружаем полоску в проявитель еще на 3-4 см, продолжая отсчет. Соответственно первый погруженный участок потемнеет в первую очередь, а затем начнет темнеть и второй участок. В некоторый момент оба участка сравняются по цвету, и граница между ними будет неявно выражена. Вслед за этим краевой эффект начнет проявляться. Вынимаем полоску пленки из проявителя и внимательно следим за границей между двумя участками. Останавливаем секундомер в тот момент, когда этот эффект (граница) будет максимально выражен. Пусть отсчет секундомера при этом остановлен на 24 секунде. Делим это значение на коэффициент 4 и получаем время проявки – около 6 минут.

Способ 2:

Отрезаем полоску засвеченной пленки и, отсчитывая секунды, на счет ноль погружаем ее в проявитель. Сначала этот участок намокнет и станет светлее сухой, а затем начнет темнеть. Останавливаем секундомер в тот момент, когда граница между мокрой и сухой частью исчезнет. Пусть отсчет секундомера при этом остановлен на 19 секунде. Умножаем это значение на коэффициент 0,367 получаем время проявки – около 7 минут.

Способ 3:

Можно воспользоваться и другим способом. Опустить засвеченную пленку в проявитель и дождаться ее полного почернения. Время нахождения в проявителе и будет временем проявки. Однако оптическую плотность проявленных таким образом негативов следует проверить на сканнере после обработки в фиксаже. При одновременном сканировании почерневшей пленки и неэкспонированной пленки отмытой в фиксаже распределение плотностей теоретически должно находиться в областях 0 и 255 соответственно, по grayscale шкале 0-255. Однако на практике достичь этого невозможно, поскольку на плотность неэкспонированных участков влияет как плотность самой основы пленки, так и вуаль. Поэтому плотность неэкспонированных участков, как правило, ниже 255.

.......................................................................................................................................................................................

   Фиксаж

Для отмывки непроявленного серебра я использую простой кислый фиксаж.

В 2 литрах дистиллята растворяем 600 г гипосульфита натрия [Na₂S₂O₃×5H₂O]. Для блокировки процесса проявления оставшимися от проявителя в слое эмульсии реагентами, в 500 мл воды разводим 60 г натрия сернистокислого [Na₂SO₃] (сульфит натрия) и добавляем этот раствор к 2 литрам раствора гипосульфита натрия, перемешиваем, и добавляем 3 мл ледяной уксусной кислоты до pH=6-6,1, доводим объем до 3 литров. Фиксаж готов.
Если перед уксусом не добавить натрия сернистокислого (он принимает на себя кислотный удар), то сера выпадет осадок. Фиксаж работать будет плохо.

Закреплять в кислом фиксаже можно и минуты 2, но лучше подержать подольше (4-8 мин).
Можно использовать удвоенное время проявки, но для верности время фиксации лучше определить.
Для этого погружаем тестовый лист неэкспонированной пленки в фиксаж и дожидаемся его полного просветления.
Время обработки пленки в фиксаже можно считать равным утроенному времени полного просветления тестового листка неэкспонированной пленки.

По мере увеличения числа обработанных пленок, в том же объеме фиксажа увеличиваем и время обработки пропорционально увеличению времени проявки (см. график увеличения времени проявки).

Bместо уксуса, для подкисления фиксажа, можно пропорционально добавить сульфат аммония или хлорид аммония – нашатырь.

.......................................................................................................................................................................................

   Промывка

При окончательной промывке негативов в дистилляте в качестве антистатика можно добавить, например, ЛЕНОР из расчета 10 мл на 3 литра дистиллята.

.......................................................................................................................................................................................

   Вуаль

На старых пленках или хранившихся в несоответствующих условиях (при повышенной температуре или влажности), при проявке в проявитель стоит добавить антивуалирующие вещества, например, йодид калия или бензотриазол.

Йодид калия добавляют обычно от 0.1 до 1 г на 1 литр проявителя. Результат исчезновения вуали смотрим по тестовым пробам, увеличивая концентрацию йодида в проявителе. Если йодида калия добавлено излишне, то можно получить небольшое снижение проработки в светах, но на просроченных пленках (выпущеных 5-15 лет до того как), включая свежую ФТ-41, отследить это сложно. Йодид хорошо растворим при комнатной температуре. Например, разводим 30 г KJ в пробирке, доливаем водой до 30 мл. Сливаем во флакон из темного стекла. Получается: в 1 мл содержится 1 г, или в 0,1 мл – 0,1 г. Хранится в темном месте неделями.

Можно использовать и бензотриазол [C₆H₅N₃], но с ним расчет сложнее.
Для пленки KODAK: растворяем 1 г бензотриазола в 100 мл спирта. Добавляем спиртовой раствор бензотриазола в проявитель, начиная с 10 мл на 1 литр проявителя (т.е. 0,1 г/литр). Если при этом плотность негатива остается удовлетворительной, то увеличиваем концентрацию - 20 мл на 1 литр проявителя (т.е. 0,2 г/литр). Время проявки при этом увеличиваем на 10%. Далее используем 0,3 г/литр с поправкой времени проявки 20% и т.д.

Если же в проявитель не были добавлены антивуалирующие вещества, то от вуали можно избавиться и в процессе осветления негативов.

.......................................................................................................................................................................................

   Осветление

Если пленка переэкспонирована, или плотность негативов после обработки слишком велика, или же на негативе присутствует вуаль, то часть серебра, в том числе и неспецифически проявленного, можно отмыть. Для этого растворяем Гексацианоферрат (III) калия (красная кровяная соль или красное синькали, K₃[Fe(CN)₆] ), в количестве 10 г на 1 л дистиллята, получаем расвор лимонного цвета.

Обрабатываем на свету при комнатной температуре. Сначала вымачиваем негатив в дистиллированной воде в течение 5 минут, затем переносим негатив в раствор красной кровяной соли на 1 мин, далее промываем 1-2 мин в холодной проточной воде, и отмываем лишнее серебро в простом фиксаже (200 г гипосульфита натрия [Na₂S₂O₃×5H₂O] в 1 л дистиллята) в течение 5 мин.
Промываем 1-2 мин в проточной воде, затем в дистилляте с антистатиком, сушим в шкафу для сушки пленок или в потоке воздуха под вытяжкой. Результат отмывки проверяем при оцифровке сканером.

Качество отмывки проверяем при оцифровке. Независимо от того, достигнут ли желаемый результат, негатив сканируем с разрешением не ниже 3200 dpi (методтку сканирования см. в соответствующем разделе) и сохраняем изображение текущего состоянии негатива, вернуть уже не удастся. Если просветление недостаточно, то повторяем процедуру.

Процесс обработки осветления негатива в какой-то мере сходен с пул-процесом проявки, при котором пленка после избыточной экспозиции недопроявляется. Однако при этом есть вероятность потери полутонов. При использовании проявки с последующей отмывкой серебра, в отличие от пул-процеса, переэкспонированный негатив проявляем стандартно по времени, что позволяет проявить полутоновые детали, а затем при отмывке удаляем излишнее проявленное серебро. Т.е. если пленка экспонирована как менее чувствительная (более длительная экспозиция), а излишняя плотность проявилась при стандартном времени проявки, то в процессе отмывки можно не только удалить излишние плотность и вуаль, но и подтянуть качество общей картины. Так, если проводить процедуру отмывки излишнего серебра без перемешивания растворов, то при сохранении полутонов, не только будет выровнена плотность по всей площади негатива, но и усилены тонкие детали на засвеченных участках.