Инструменты и Методы анализа
Оборудование | Методы и протоколы | Программы | Реактивы и материалы | Стоимость анализа
....................................................................................................................................................................................... Электронная микроскопия ⇒ Приготовление заливочных сред
Эквивалент эпоксидной смолы
Рецептура приготовления смол
Твердость эпоксидных блоков
Смесь ингредиентов с катализатором
Полимеризация
Правила хранения готовых растворов смол
Epon 812 советских времен
Смесь смол Epon-Araldit
Смесь Спурра низкой вязкости
.......................................................................................................................................................................................
Эквивалент эпоксидной смолы
Для приготовления заливочной среды рекомендуется использовать гравиметрические (массовые) характеристики компонентов,
нежели объемные доли. Стандартом для приготовления смеси должно служить значение массы вещества на один эквивалент
эпоксидной смолы (WPE - Weight Per Epoxide equivalent). Из значения WPE можно определить оптимальные
количества ангидридов DDSA и NMA
в граммах для достижения стехиометрического баланса между компонентами. В таком случае количество не прореагировавших
компонентов смеси сводится к минимуму, что гарантирует получение воспроизводимой степени твердости и пластичности блоков,
и в конечном итоге воспроизводимого качества получаемых срезов ткани.
Масса эквивалента эпоксидной смолы у разных смол различна и может варьировать в зависимости от производителя и от партии к партии.
Так значения WPE для Epon-812 вышедшего из производства, колеблются
в широком диапазоне, WPE=140-160. В производственных спецификациях для аналогов Эпона-812 для смолы LX-112 WPE составляет
140-150, для EMBed 812 WPE=140-180, для Jembed 812 WPE
около 145, для Eponate WPE=140–145, для DER 332-732 WPE=305-335, для SPI-PON812 используемого в настоящее
время в нашей лаборатории WPE = 1.22 (или 122). Неосведомленность в значениях WPE может стать возможной
причиной плохой заливки ткани и некачественной резки блоков. Для того чтобы получать стандартные по
свойствам блоки для резки, производители рекомендуют использовать формулы на основе значений удельных масс
эпоксидных смол прошедших соответствующий анализ и ангидриды с тестированной чистотой. Даже когда ангидрид
содержит не более 5% свободных кислот и/или воды, можно получить слишком мягкий блок, содержащий поры и плохо
поддающийся резке. Значения удельного веса, как правило, указаны на этикетке флакона с реагентом и обозначаются
как WPE.
Рецептура приготовления смол
Чтобы приготовить смолу для заливки образцов на весовой основе следует использовать
точное значение WPE эпоксидной смолы и следующую простую формулу:
|
MA ME МrA 0,7 WPE |
– масса необходимого ангидрида в граммах; – масса эпоксидной смолы в граммах; – молекулярный вес ангидрида; – коэффициент отношения количества ангидрида к WPE*; – масса эпоксидной смолы, содержащая один массовый эквивалент эпоксида. |
* Рекомендуемое отношение ангидрида к эпоксидному эквиваленту, согласно работе Джона Люфта
(Luft J.H. J. Biophys and Biochem Cytol, 1961, 9: 409), составляет 0.7 что улучшает свойства резки, в отличие
от рекомендованных значений от 0.9 до 1.0 для использования этих смол в промышленности. Молекулярная масса
NMA и DDSA составляет 178.19 и 266.37 соответственно.
Отмечу, что NMA и MNA, у некоторых компаний NMA называется Nadic Methyl Anhydride (NMA), а
у других – Methyl Nadic Anhydride (MNA), но это один и тот же реактив - Methyl-5-norbornene-2,3-dicarboxylic anhydride,
у которого есть и синонимы: Methyl nadic anhydride; Methyl himic anhydride; Methylbicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic anhydride.
Для того чтобы получить полную заливочную смесь на основе Эпона сначала следует приготовить
два тщательно перемешанных раствора смол:
один будет содержать DDSA (Раствор A), а другой будет содержать NMA (Раствор Б).
Растворы следует смешивать под вытяжкой.
Приготовлениe раствора А.
Пусть значение WPE для LX-112 у нас 144 и брать для смеси изначально мы будем 35 г смолы LX-112.
В таком случае необходимая масса DDSA = 35/144 × 266 × 0,7 = 45,26 г.
1) наливаем 45,26 г DDSA в 100 мл флакон;
2) добавляем 35 г LX-112;
3) закрываем и энергично и тщательно перемешиваем, но так чтобы не образовывалось пузырьков.
Приготовлениe раствора Б.
Пусть значение WPE для LX-112 у нас 144 и брать для смеси мы будем 35 г смолы LX-112.
В таком случае необходимая масса NMA = 35/144 × 178 × 0.7 = 30,28 г NMA.
1) наливаем 30,28 г NMA в 100 мл флакон;
2) добавляем 35 г LX-112;
3) закрываем и энергично и тщательно перемешиваем, но так чтобы не образовывалось пузырьков.
Для удобства будущих разведений можно сделать таблицы, которые включают необходимые массы ангидридов для различных удельных масс эпоксидов в пересчете на начальное значение массы эпоксида равное, например, 100 г или 35 г. (Таблица 1).
Таблица 1a. Количества ангидридов для смеси с эпоксидами различных удельных масс LX-112 с начальной массой 100 г.
|
WPE LX-112 |
Масса DDSA, г (Раствор А) |
Масса NMA, г (Раствор Б) |
|
140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 |
133 132 131 130 130 128 128 127 126 125 124 |
89 88 88 87 87 86 85 85 84 84 83 |
Таблица 1б. Количества ангидридов для смеси с эпоксидами различных удельных масс с начальной массой 35 г.
|
WPE эпоксида |
Масса DDSA, г (Раствор А) |
Масса NMA, г (Раствор Б) |
|
140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 160 |
46,55 46,22 45,89 45,57 45,26 44,94 44,64 44,33 44,03 43,74 43,45 43,16 42,88 42,60 42,32 42,05 41,78 41,51 41,25 40,73 |
31,15 30,93 30,71 30,50 30,28 30,07 29,87 29,67 29,47 29,27 29,07 28,88 28,69 28,50 28,32 28,14 27,96 27,78 27,60 27,26 |
Если же мы используем один и тот же компонент, из одной партии, например с удельным весом 1.22, то удобно было бы составить таблицу для разведения различных объемов (Таблица 2). Строка выделенная жирным шрифтом соответствует разведению во флаконах объемом по 100 мл с начальной массой SPI-PON 812 равной 35 г, в этом случае конечная масса смесей А и Б составит 88,42 и 70,75 мл соответственно.
Таблица 2. Для разных начальных объемов эпоксида SPI–PON 812 с WPE=122.
|
Исходное количество эпоксида, г |
WPE SPI–PON 812 |
Масса DDSA, г (Раствор А) |
Масса NMA, г (Раствор Б) |
|
10 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90 100 |
122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 |
15,26 30,52 38,16 45,79 53,42 61,05 68,68 76,31 91,57 106,84 122,10 137,36 152,62 |
10,21 20,43 25,53 30,64 35,75 40,85 45,96 51,07 61,28 71,49 81,70 91,92 102,13 |
.......................................................................................................................................................................................
Твердость эпоксидных блоков
Твердость эпоксидных блоков для приготовления срезов зависит от соотношения ингредиентов, смесей А и Б. Если использовать для заливки образцов ткани только раствор А, то получатся очень мягкие блоки, если же использовать для заливки только раствор Б, получатся очень твердые блоки. В зависимости от плотности исследуемой ткани следует подбирать и твердость блоков. Для твердых тканей должна быть твердая заливка, для мягких более мягкая. Иначе при резке ткань или будет выкрашиваться из заливки или сминаться и хороших срезов не получится. Соотношение растворов А и Б и получаемые значения твердости блоков описаны в вышеупомянутой статье Люфта. Стоит отметить, что для получения необходимых соотношений ингредиентов смесей А и Б использованы граммы, тогда как в соотношении смесей А и Б для достижения требуемой твердости блоков использованы объемные доли (Таблица 3).
Таблица 3. Доли смесей А и Б для получения относительной твердости блоков.
|
Смесь А, мл (с DDSA) |
Смесь Б, мл (с NMA) |
Общий объем, мл |
катализатор DMP-30* |
Относительная твердость блоков |
|
10 |
0 |
10 |
0.14 |
очень мягкие |
|
7 |
3 |
10 |
0.14 |
мягкие |
|
5 |
5 |
10 |
0.14 |
средней твердости |
|
3 |
7 |
10 |
0.14 |
твердые** |
|
0 |
10 |
10 |
0.14 |
очень твердые |
* В исходной таблице работы Люфта значение DMP-30 соответствует 0,15 г.
** Твердые блоки для получения больших серий ультратонких срезов мозга используются,
в частности, в лаборатории Кристен Харрис..
Для новичков в электронной микроскопии рекомендуется начинать со смеси состоящей из 6 частей раствора А и 4
частей раствора Б. Это соотношение дает блоки средней твердости. Однако некоторые пробы для электронно-микроскопического
анализа требуют сравнительно твердых блоков. Например, исследование структуры чистого коллагенового геля, возможно
только на твердых блоках. Более того, для такой задачи рекомендуется использовать такие заливочные среды как,
DER 332-732 в сочетании с DDSA и MNA (Lockwood, W.R. Langston, Jr. L.L. Anatomical Record, 1964, 150(2): 129-139.)
по тому же принципу стехиометрических отношений, который описан выше для аналогов Эпона.
SPI-PON 812 (WPE 1.22)
Вкратце процедуры получения заливочной среды на основе SPI-PON 812 следующие:
1) для раствора А берем 35 г SPI-PON 812, добавляем 53,42 г DDSA, перемешиваем;
2) для раствора Б берем 35 г SPI-PON 812, добавляем 35,75 г NMA, перемешиваем;
3) согласно таблице 3 подбираем количества растворов А и Б, например 5 г А и 5 г Б, перемешиваем;
4) добавляем катализатор 0,14 г, перемешиваем;
5) полную смесь с катализатором и смеси А и Б замораживаем до использования.
Смесь ингредиентов с катализатором
Смесь ингредиентов с катализатором иногда называют полной смесью, что в отечественной электронной микроскопии
внесло некоторую путаницу, поскольку другие исследователи неполной смесью называют смолы разведенные растворителями,
например, ацетоном или спиртом, для предварительной пропитки ткани. Добавляем к растворам А и Б 140 мг (или 115 мкл) DMP-30 согласно Таблице 3.
Энергично, но так чтобы не образовывалось воздушных пузырьков, перемешиваем в течение не менее 5 мин до
однородной смеси. Недостаточно однородная смесь может привести к неоднородной полимеризации и,
соответственно, к плохому качеству срезов.
Катализаторы DMP-30 и DMAE в сравнении с BDMA
По сравнению с DMP-30 менее вязкий BDMA лучше проникает в ткань, соответственно при использовании BDMA
получается более равномерная пропитка ткани. Это так же справедливо при сравнении BDMA с DMAE. Поэтому
при выборе заливочной среды и катализатора производители рекомендуют отдавать предпочтение BDMA, нежели
DMP-30 или DMAE. Кроме того BDMA имеет более длительный срок хранения.
Стоит также отметить, что для того чтобы получить оптимальные результаты используя BDMA вместо
DMP-30 следует использовать следующие соотношения катализаторов, если при использовании DMP-30
обычно добавляют 1,5-2% к смеси эпоксида и ангидрида, то при использовании BDMA следует добавлять от 2,5 до 3% катализатора.
Полимеризация
Готовую смесь смол с катализатором для полной полимеризации можно поставить на ночь в термостат с
температурой 60°С, или провести согласно следующей схеме, для улучшения пропитки образца:
1. Оставляем на ночь при 45°С (или 18-20 ч)
2. Переносим в 60°С на 24 ч.
3. Вынимаем блок, даем остыть до комнатной температуры.
Блок готов к резке.
Можно использовать и другие схемы, например, для заливки мелких, порядка 50 мкм объктов требующих прицельной микротомии.
Такие объекты можно оставить в термостате с температурой 37°С в небольшом количестве смолы на ночь или на сутки.
Смола частично заполимеризуется, что позволит сориентировать объекты в положение удобное для резки,
добавить смолы и поставить в термостат с
температурой 60°С до полной полимеризации.
Как хранить смолы
Смеси А и Б, даже приготовленные более 6 месяцев назад использовать можно, однако только при том если они хранились
в холодном состоянии под инертным газом. Лучше хранить в морозилке. Прежде чем вскрывать флакон с замороженной смолой
его следует нагреть при комнатной температуре, до той же температуры или чуть теплее, во избежание образования конденсата.
Даже небольшая разница температур может привести к сорбции воды из воздуха, и как следствие к мягким блокам, плохо
поддающимся резке. Кроме того, наличие воды может быть причиной постепенного гидролиза ангидридов до свободных кислот,
что является одной из причин мягких блоков, с которыми неудобно работать. Для того чтобы защитить смолы от воды,
емкости со смолами стоит хранить "под шапкой" инертного газа, аргона или азота, для предотвращения загрязнения
водой захваченной из сырого воздуха.
Вскрытые флаконы с катализаторами и ангидридами, также стоит хранить при отрицательных температурах.
Epon 812 советских времен
Sigma-aldrich сейчас выпускает Epoxy Embedding Medium (45345) аналог Эпона 812 производимого швейцарской компанией Fluka Chemie.
Та же компания раньше выпускала Epon 812 (45345) и в некоторых лабораториях до сих пор можно найти невскрытые
флаконы с этой смолой. Несмотря на то, что этим смолам уже не один десяток лет использовать их можно.
Однако в советские времена значения WPE на флаконах с Epon 812 не были указаны.
Это значение можно определить приблизительно, исходя из рекомендуемой формулы для приготовления
заливочной смеси с сайта производителя, поскольку формула компонентов смеси не менялась с 1961 года и
в качестве источника Sigma/Fluka приводит ту же работу Люфта (Luft J.H. J. Biophys and Biochem Cytol, 1961, 9: 409).
Так, например, в рецептуре к Epoxy Embedding Medium (EEM) Fluka рекомендует следующие соотношения:
Раствор А = 5 мл EEM + 8 мл DDSA; Раствор Б = 8 мл EEM + 7 мл NMA.
Смесь A и Б в соотношении 1:1 дает блоки для стандартных задач, несколько большее количество раствора Б,
соответственно дает более твердые блоки.
Смесь смол Epon-Araldit
Один из рецептов от производителей:
Embed 812: 25 г или 25 мл
Araldite 502: 16 г или 15 мл
DDSA: 48 г или 55 мл
DMP-30: 1.6 г или 1.5-2 мл
Другой рецепт, используемый в нашей лаборатории, в зависимости от твердости ткани позволяет получать до 60-100
серийных полутонких срезов одним стеклянным ножом (в граммах - мл×плотность).
Epon 812: 15 мл (EMBed-812×1.13=16.95 g, SPI-PON×1.22=18.3 g, Fluka×1.24=18.6 g)
Araldite M: 15 мл (AgarCY212×0.8695=13.04 g)
DDSA: 40 мл (SPI-EMS×1.005=40.2 g, Agar×1.01=40.4 g)
DMP-30: 0.4 мл (x0.975=0.39 g)
Смесь Спёрра низкой вязкости
Смотрим работу Spurr AR, 1969. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastruc Res, 26, p. 31.